人二倍体细胞狂犬病疫苗为冻干粉针剂。我国自2004 年开始研制人二倍体细胞狂犬病疫苗,2014 年,我国首家拥有自主知识产权的冻干人用狂犬病疫苗上市。 人用精制 VERO细胞狂犬病疫苗及精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗均为轻度混浊白色液体,长度超过三十的dsRNA会引起干扰

人二倍体细胞狂犬病疫苗为冻干粉针剂。我国自2004 年开始研制人二倍体细胞狂犬病疫苗,2014 年,我国首家拥有自主知识产权的冻干人用狂犬病疫苗上市。 人用精制 VERO细胞狂犬病疫苗及精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗均为轻度混浊白色液体,长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性问题是世界性的风险 ,久放形成可摇散的沉淀,含硫柳汞防腐剂。该疫苗对于防止伤口感染具有相当好的作用。

根据中研研究院研究出版的《2020-2025年中国狂犬疫苗行业市场前瞻与未来投资战略分析报告》统计分析显示:

一、中国狂犬疫苗行业发展历程

我国1980年前生产和使用的狂犬病疫苗为成年羊脑组织悬液的疫苗,接种后不良反应大,特别是由脑组织引起的变态性脑脊髓炎不良反应更为严重,同时免疫效果也不够满意。为解决这些问题,开始研制细胞培养狂犬病疫苗,有以下两种类型。

2.1地鼠肾细胞疫苗

1965年开始由卫生部武汉生物制品研究所牵头,中国药品生物制品检定所、卫生部长春、兰州生物制品研究所等单位合作,用生产羊脑疫苗的北京株狂犬病固定毒株(1931年从北京病人脑分离的街毒,经兔脑传代适应的固定毒)通过原代地鼠肾细胞适应传代,获得aG株适应株,用该毒种开始生产地鼠肾细胞疫苗,地鼠肾细胞疫苗经历过以下几个阶段的改进提高。

2.1.1原制佐剂疫苗用aG株毒种接种地鼠肾细胞培养,培养液经福尔马林灭活后加入Al(OH)3作为佐剂即原制佐剂疫苗。该疫苗在人体与羊脑疫苗进行过抗体应答比较,结果显示该疫苗接种3针的中和抗体水平相当于羊脑疫苗连续注射14针的水平。该疫苗于1980年应用并替代了羊脑疫苗。疫苗应用十几年,虽然接种后不再出现脑脊髓炎变态反应,但仍发生一些免疫失败病例。分析原因与疫苗未经浓缩,抗原量偏低有关,实验室效力检定效价一般只在1.3IU,未达到WHO规定的每剂量2.5IU的标准。

2.1.2浓缩原制佐剂疫苗为了提高疫苗的效价,卫生部于1993年决定生产效价\2.5IU的浓缩或浓缩纯化的佐剂疫苗,以取代普通的未浓缩佐剂疫苗。浓缩疫苗的生产工艺与原制苗类似,只是最后将疫苗原液经10万或30万分子量截留膜浓缩3~5倍制成。免疫效果明显提高,全国狂犬病病例由上世纪70年代和80年代初的每年数千例下降到90年代末的200~300例。但由于疫苗未经纯化含有一定的杂蛋白,大面积接种后虽未发现神经并发症病例,过敏反应却时有发生,如注射部位疼痛、大面积红肿、全身性荨麻疹、过敏性紫癜、血管神经性水肿等,个别出现过敏性休克,神志不清,并有危及生命者。严重不良反应发生率约5%~10%,且这些不良反应均需临床处理才能缓解。分析浓缩疫苗不良反应增强的原因,主要是疫苗生产过程中加入异性蛋白如小牛血清、含狂犬病毒的豚鼠脑组织用作毒种和培养病毒的地鼠肾细胞蛋白。这些本来极微量的杂蛋白经浓缩后含量加大,增加了反应原含量。陈学奎等以豚鼠为实验动物模型,将地鼠肾细胞狂犬病浓缩疫苗成品致敏豚鼠后,以疫苗内不同成分静脉注射,结果证实,地鼠肾细胞成分是引起过敏的重要物质,过敏的严重程度随制品浓缩倍数的增大而增大。

2.1.3浓缩纯化佐剂疫苗鉴于上述原因,国家药品监督管理局决定尽快生产和使用纯化的狂犬病疫苗替代未纯化的浓缩疫苗。这种疫苗是在浓缩佐剂疫苗的生产基础上,对病毒培养液进行浓缩和纯化。沈阳安迪生物公司(现大连金港公司)和辽宁生物技术公司经较长时间的纯化技术研究并与Pharmacia公司合作,最终采用Sepharose4FF凝胶柱层析技术纯化。纯化后病毒回收率达77.4%,杂蛋白去除率达99%以上,残余牛血清<12.5ng/mL,疫苗效价在7IU/剂以上。也有厂家用DEAESepharoseCL-6B离子交换层析或醋酸鋅沉淀后柱层析技术,再经0.22Lm滤膜过滤除菌,加Al(OH)3制成。有的厂家将传统的福尔马林灭活病毒改用1B4000的B-丙内脂。8个厂家的8批人体临床观察结果显示,未发生中、重度异常反应。据发热、红肿、硬结、皮疹等指标统计,3针和5针免疫的不良反应率为0%~9.7%。中和抗体应答结果,按暴露前免疫方案接种,3针后14d抗体阳转均达100%,抗体滴度GMT为9.8~24.2,按暴露后方案接种5针后的中和抗体,阳转率均达100%,GMT为5.7~39.8。

但当时没有要求作暴露初免后10~14d的早期抗体应答,所以对这种疫苗的早期抗体应答情况不清,而国外对狂犬病疫苗新产品均要求作免疫后不同时间的抗体动态观察,特别是早期抗体对暴露后免疫成功尤其重要。而狂犬病疫苗主要用于暴露后免疫,要求疫苗快速诱生中和抗体以发挥中和抑制病毒达到保护的作用。因此有必要研制无佐剂的纯化疫苗。

2.1.4浓缩纯化无佐剂疫苗河南普新生物工程有限公司在实验性疫苗生产中,将同批疫苗原液制成加和未加Al(OH)3佐剂的两种疫苗。用无佐剂疫苗和佐剂疫苗各1批(效价均为4.2IU/mL)进行人体反应性和免疫性观察比较。结果表明,两种疫苗的不良反应均很轻,但在局部不良反应上无佐剂纯化苗低于佐剂纯化苗。两种疫苗的抗体应答,由检定所作中和效价测定,结果所有志愿者免疫前的抗体均为阴性,在首次免后7d时,佐剂苗37人中仅3人抗体阳转(\0.5IU),阳转率8.1%,而无佐剂苗31人中阳转14人,阳转率45.2%;在免后14d时佐剂苗阳转率59.5%,无佐剂苗为100%;在免后45d时佐剂苗和无佐剂苗的阳转率均为100%。结合近年来发现纯化佐剂疫苗接种后免疫失败病例较多,出现一些潜伏期短的免疫失败病例,可能与佐剂疫苗抗体产生缓慢,得不到及时保护有关。参考国际上所有暴露后免疫用疫苗都是不加佐剂的疫苗,中检所多次提出并已经国家药品监督管理局的同意,生产无佐剂的狂犬病疫苗。无佐剂纯化疫苗的生产工艺与佐剂疫苗相似,只是在最后阶段,疫苗内不加Al(OH)3佐剂,加适当稳定剂后制成。根据不同厂家的无佐剂疫苗临床观察,不良反应较以往的佐剂疫苗轻,在初免后14d中和抗体都能100%阳转。

2.2Vero细胞狂犬病疫苗的发展

近年来,我国已研制成功以Vero细胞为基质的纯化狂犬病疫苗。Vero细胞由中国药品生物制品检定所从美国ATCC引进,细胞代次在126左右。用于生产Vero细胞疫苗的毒种,经国家药品管理局批准的有2株,1株为生产地鼠肾细胞疫苗的aG株,另1株为CTN-1株。

2.2.1CTN-1株Vero细胞疫苗CTN-1疫苗株由中国药品生物制品检定所建株和保存。原始病毒1956年分离自山东省淄博市死于狂犬病病人的脑组织,病毒经小白鼠脑内连续传56代后,检定证实为狂犬病固定毒,又经人二倍体细胞KMB-17株连续传50代以上即CTN-1株。CTN-1株经全面检定未发现外来病毒污染,抗原性与固定毒一致,并具有良好的免疫原性。CTN-1株于1983年和2005年经WHO狂犬病专家委员会确认为符合要求的狂犬病疫苗生产用毒种。

李宏玲等用CTN42代和CTN103代毒种在Vero细胞培养中适应传代,病毒传至8代后滴度均有显著上升,传至17代仍稳定在较高水平上,表明CTN株可以在Vero细胞培养内适应达到较高滴度的病毒量,适用于疫苗生产。董关木等进一步证实CTN株可在Vero细胞培养内快速适应,滴度达到7.0log/mL以上并可多次收获病毒培养液。桑爱军等用小鼠试验还证明CTN-1制备的疫苗对1992年国内分离的狂犬病街毒(SBDO7株)具有良好的保护作用,脑内或肌内攻击保护效果可达到88.9%和90.0%,表明CTN-1株的抗原性与国内的狂犬病流行株一致,免疫原性高,适用于狂犬病疫苗的生产。

沈阳安迪生物公司和辽宁生物技术公司从检定所获得CTN-1毒种后,在Vero细胞适应10~15代后,用于疫苗生产。张玉慧等还将CTN株适应地鼠肾细胞,用同批地鼠肾细胞制备aG株和CTN株疫苗各3批,并进行NIH效力试验和免疫豚鼠后中和抗体水平的比较,结果两项试验CTN株制备的疫苗均高于aG株制备的疫苗。

目前已有多家应用CTN-1株生产Vero细胞疫苗并取得生产文号。

2.2.2aG株Vero细胞疫苗国内李宏玲、曾蓉芳、顾悦翔等都曾经用aG株在Vero细胞培养内适应传代,表明经传代后病毒滴度可以提高,达到疫苗生产水平。用aG株适应Vero细胞制备灭活疫苗,其生产工艺与地鼠肾细胞纯化疫苗相似,1999年开始已有多家取得生产文号和生产,但都是加佐剂液体剂型。2003年以来已有一些厂家开始研制纯化无佐剂疫苗并取得生产文号或完成临床观察。上海生物制品研究所用生物反应器微载体细胞培养技术生产的无佐剂疫苗已完成临床观察。

除应用以上2株毒种生产的Vero细胞疫苗外,近年来辽宁成大生物技术有限公司引进国外的巴斯德PV毒种,利用生物反应器,高密度微载体细胞培养技术研制成功无佐剂Vero细胞疫苗。与法国维尔博进口疫苗对比观察,未显示差别,表明该疫苗亦具有良好的安全性和免疫原性。

狂犬病抗血清的发展

狂犬病抗血清种类按其来源分为动物源(主要是马)与人源血清。狂犬病马免疫血清为异源性血清,虽然来源方便,经济,可大量生产,但使用后不良反应高。

20世纪80年代末由瑞士血清研究所和法国Merieux公司采用胃蛋白酶酶切精制技术,将无中和活性的Fc段切除,然后经盐析等纯化保留具有中和活性的F(abc)2段,生产一种精制抗狂犬病马血清球蛋白(ERIG),据调查引起过敏反应的发生率仅为2.85/10万,血清病不良反应率<2.0%。为进一步减少ERIG的不良反应和去除马病菌的污染,近年来法国巴斯德研制一种经过柱层析纯化和60e热灭活10h的新产品称PHT-ERIG,得到更高的纯化IgGF(abc)2片断产品,应用后不良反应更低。

我国早期生产和使用的马免疫血清,由于技术和设备条件限制,产品纯度不够,注射后不良反应较大,难于广泛应用。近年来生产技术作了较大改进,除采用蛋白酶酶切技术去除Fc外,在纯化上有的厂家也采用层析技术,使纯度和活性均较大提高,蛋白含量[170g/L,与国外产品相同;F(abc)2含量达到\60%,但较国外的\75%低。近年来在国内已广泛应用,除个别外不良反应较少发生。

人源狂犬病球蛋白(HRIG)早在20世纪70年代由Bayer厂和Merieux厂用HDCV免疫志愿者的血浆制备。该产品经人群应用后除偶而发生局部疼痛和低热外,无血清病或其他不良反应发生。但由于生产过程中使用HDCV价格高,供血员的来源以及抗体滴度要求高(15IU/mL)等困难,该产品的最终价格高,因而产量低。国内有深圳卫武光明生物技术公司和武汉生物制品研究所等企业的产品正广泛应用,并取得效果显著,不良反应少的满意结果。但由于价格较高,对收入低者仍然难于承受,有待进一步研究降低生产成本和价格。

我国当前生产的人用地鼠肾细胞和Vero细胞疫苗的近期效果和接种后的安全性已接近国外的狂犬病疫苗,但还存在以下差距:①当前大多数国产疫苗仍然是液体剂型,液体疫苗在保存、运输过程中容易影响疫苗效价;②疫苗质量不够稳定,疫苗在申报临床的人体观察中,一般都较满意,但在以后的投产和市场实际应用中,经常发现疫苗质量差,效价达不到质量标准,可能与大规模生产的技术还存在问题或质量控制不严或疫苗稳定性差等有关;③有资料表明,国外几种疫苗的免疫持久性在全程免疫后,加强1针可以达到5~10年,而国产疫苗的免疫持久性尚无资料,对再暴露后的人接种程序难于确定。

最近几年对国内自然界分离的狂犬病野毒株的基因序列分析发现,不同地区的野毒株间核苷酸和氨基酸序列有明显差异,约相差10%,特别是发现野毒株与现在用于疫苗生产的毒株间的糖蛋白基因也有较大差异,如aG株与上海株SBDO7的核苷酸和氨基酸同源性为85.8%~88.5%,与广西、宁夏分离的3株狂犬病野毒株的核苷酸同源性只有81.9%~82.7%,氨基酸同源性89.9%~90.5%;CTN株与这3株的同源性,分别为85.9%~92.5%和92.4%~93.5%,高于aG株与其他野毒株的同源性,由于糖蛋白基因与免疫原性密切相关,因此有必要深入研究当前生产用毒株与野毒株间的抗原性关系和不同疫苗对野毒株的免疫保护程度。

二、中国狂犬疫苗发展状况

1、狂犬疫苗行业发展规模

宠物数量的增加,带动了狂犬疫苗行业的发展规模。截止2017年,狂犬疫苗行业市场规模达到47.4亿元,随着“假疫苗”事件的发酵,市场的整顿与调节不断深入,预计2018年,狂犬疫苗行业不会出现大幅度的增长,行业市场规模约为48.3亿元。

图表:2016-2018年我国狂犬疫苗行业发展规模

数据来源:国家统计局、中研普华产业研究院

2、狂犬疫苗行业供需状况

近年来,国内狂犬疫苗每年的批签发总数量维持在6000-8000万支,即1200-1600万人份,市场使用量较大。目前,Vero细胞纯化狂犬疫苗仍是国内使用的主流疫苗,2017年市占比(数量)约90%,人二倍体细胞狂犬疫苗由于产能问题,2017年仅批签发99.5万支。以批签发数量为口径,根据各年各种类狂犬疫苗的采购均价计算,近年来国内狂犬疫苗年产值维持在30-50亿元之间,2017年位列国内疫苗之首,市场空间巨大。

图表:2016-2018年狂犬疫苗行业批签发总数量

数据来源:国家统计局、中研普华产业研究院

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